目的 探讨复方血栓通胶囊对叔丁基过氧化氢(t-BHP)诱导体外培养的人视网膜色素上皮细胞(hRPE)和人视网膜血管内皮细胞(hRVECs)氧化损伤的保护作用及其机制。
方法 原代培养hRPE和hRVECs后取P3-P5进行实验。应用MTT法筛选复方血栓通的最佳药物浓度;用MTT及Annexin V/PI双染法检测复方血栓通及其各单方药物对hRPE氧化损伤的保护作用及复方血栓通对t-BHP诱导的低、中、高不同损伤程度的hRVECs的保护作用;倒置相差显微镜和Hoechst 33258染色观察各组细胞的形态和细胞核;MitoSOX染色检测hRPE线粒体中ROS的产生;JC-1染色检测hRPE线粒体膜电位的变化;ELISA法检测hRPE分泌的VEGF浓度;免疫荧光检测hRVECs硝基酪氨酸(NT)及8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)的水平;Western blot检测hRVECs6、12和24小时各组细胞NF-κB、P53、Bcl-2 和Bax的蛋白表达水平。
结果 不同浓度的复方血栓通均能提高hRPE和hRVECs的细胞存活率,且以0.25mg/ml的保护作用最佳;细胞存活率、凋亡及坏死率的结果显示复方血栓通较各单方药物的保护作用更为明显,且对不同损伤程度的hRVECs均有明显的保护作用;模型组多数细胞肿胀、变圆、漂浮和核固缩,而复方血栓通组损伤的细胞明显减少;与较模型组相比,复方血栓通组hRPE中的线粒体内ROS的产生、线粒体膜电位的下降和分泌的VEGF明显减少;hRVECs中的NT及8-OHdG的产生明显减少,NF-κB、P53和Bax的蛋白表达水平明显降低,而Bcl-2的表达升高。
结论 复方血栓通胶囊对t-BHP诱导hRPE和hRVECs的氧化损伤具有保护作用,其保护作用较各单方药物更为明显,且对高程度的损伤仍具有非常显著的保护作用,其作用机制为清除ROS,阻止线粒体膜电位的下降,抑制VEGF的分泌,减少蛋白及DNA的氧化损伤,下调NF-κB、P53和Bax的表达并上调Bcl-2的表达,从而抑制细胞凋亡和坏死,提高细胞存活率。 |